ИФА диагностика инфекционных заболеваний
ИФА — иммуноферментный анализ ( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) это иммунологический лабораторный метод который позволяет выявить вещества белковой природы.
Иммуноферментный анализ (ИФА) – позволяет количественно оценить титр антител в сыворотке/плазме крови против соответствующего антигена.
Антиген — это чужеродная белковая молекула, попавшая в организм животного или же человека с бактериальной, вирусной или другой инфекцией. В свою очередь Антитело — это иммунная клетка (иммуноглобулин), вставшая на защиту живого организма при обнаружении в нем чужеродных агентов.
Выработку специфичных антител провоцируют сами же антигены при попадании в кровь животного. В этом противостоянии организма в ответ на атаку инфекционного возбудителя антитела как бы помечают собой антигены, что при исследовании сывороток крови и детектируется (выявляется) в лабораториях. То есть в собранном биоматериале можно отследить не только наличие инфекции, но и ее следы уже после того, как животное полностью выздоровело. А также, понять эффективность проведенной раннее вакцинации.
При проведении ИФА-анализа можно поймать следующий класс иммуноглобулинов:
- Иммуноглобулины М (IgM). Свидетельствуют о том, что инфекционный процесс в организме только набирает свою силу. То есть инфицирование произошло совсем недавно;
- Иммуноглобулины G (IgG). Способствуют уничтожению антигенов через несколько дней после внедрения инфекции в организм человека. Иммуноглобулины G могут находиться в организме достаточно долго, формируя иммунитет к определенному возбудителю;
- Иммуноглобулины Е (IgЕ). Свидетельствуют о паразитарных инфекциях в организме. Он же говорит и об атопических реакциях при аллергии.
В основе иммуноферментного анализа лежит собственно специфическая реакция антиген-антитело, в результате которой происходит образование стабильных легко детектируемых комплексов. Комплексообразование происходит в количественном отношении, обусловленном аффинностью взаимодействия, концентрациями компонентов и условиями реакции. Титр антител можно оценить по количеству образовавшихся иммунных комплексов. Комплекс антиген-антитело обычно выявляют с помощью фермента, пришитого к антителу.
Принцип проведения ИФА
На поверхности носителя иммобилизуют антиген, к которому добавляют подготовленную тестируемую сыворотку (свиньи, птица, КРС), инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых ферментов вторичных противо-(свиных, птичьих, КРС) антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в пропорциональной зависимости от концентрации антигена в исследуемой пробе. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется её высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью и простотой детекции. В качестве субстратного реагента стандартно применяется о-фенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ) с перекисью водорода, продукт окисления которых регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют «стоп реагент», который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп реагента» применяют серную кислоту, которая восстанавливает окислительную реакцию субстрата. Учет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450–650 нм.
Чем определяет специфичность и чувствительность ИФА-реакции
Для создания чувствительной и надёжной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, отвечающие определённым критериям. Во-первых, они должны быть иммуногенными, то есть в инфицированном организме должны вырабатываться антитела именно к этим антигенам в ответ на введение возбудителя. Во-вторых, антигены должны быть специфичными, то есть характерными для конкретного возбудителя и не дающих перекрёстных реакций с антителами к возбудителям других заболеваний. Кроме того, помимо рационального выбора антигенов большое влияние на конечный результат диагностики имеет качество очистки антигенов, особенно если они были получены с помощью рекомбинантных технологий.
Наша технология получения рекомбинантных белков позволяет получить и очистить практически любой вирусный и бактериальный антиген. Выполнение этой задачи состоит из 3 этапов:
Выбор иммуногенов
На этом этапе мы отбираем потенциальные наиболее иммуногенные белки-кандидаты. Мы проводим таксономический анализ возбудителя, собираем данные о структуре поверхностных белков возбудителя и их гомологов. В случае вирусного возбудителя особое внимание уделяется белкам капсида, в случае бактериального — поверхностным мембранным белкам. На основании анализа полученных данных мы выбираем наиболее экспонированные в окружающую среду эпитопы возбудителя, против которых у хозяина могут вырабатываться антитела.
Наработка антигенов в бакуловирусных векторах
Основная проблема возникает при получении рекомбинантных белков в бактериальных системах E.coli. Как правило, именно эти системы и используются при наработке нужных белковых соединений. Бактерии размножаются очень быстро, что позволяет быстро и много получить необходимого белка. Как показывали наши предварительные исследования, здоровые животные в хозяйствах демонстрируют высокий титр антител против белков E.сoli. Поэтому, при использовании антигенов полученных в E.сoli мы часто получали при постановке ИФА-реакции ложноположительные результаты. В итоге, была использована система на основе бакуловирусных векторов, которые нарабатывались в коммерческих линиях клеток насекомых. Это позволило избавиться от перекрестных реакций.
Получение антител для положительного стандарта.
Для подтверждения надежности реакции и исключения ложноотрицательных реакций необходимо использовать положительный стандарт. Технология получения сыворотки антител к выделенному вирусному фрагменту для дальнейшего использования этих антител в качестве положительного стандарта, уникальна и впервые применена для такого рода диагностических тестов. Структура и стабильность полученных антител позволяет массово продуцировать их в клеточных культурах, что полностью избавляет от необходимости иметь собственный дорогостоящий виварий для их получения. Таким образом, антитела к положительному и отрицательному стандарту представлены в виде водного раствора, а не кровяной сыворотки, что повышает их стабильность и время хранения.