Особенности выполнения диагностического ПЦР-анализа

Особенности выполнения диагностического ПЦР-анализа

Успех диагностических анализов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в значительной степени вызван скоростью получения результата по сравнению со многими общепринятыми методами диагностики. Например, обнаружение и идентификация микобактерий, хламидий, микоплазм, бруцелл и других медленно-растущих бактерий можно ускорить от нескольких дней до одного рабочего дня, если клинические образцы исследуются напрямую. Другие микробные агенты, которые трудно размножать за пределами их естественного хозяина, часто обнаруживаются с помощью техник, основанных на обогащении питательной среды, поэтому применение ПЦР является единственной альтернативой демонстрации их наличия. Кроме того, метод амплификации ДНК имеет огромный потенциал в плане чувствительности и специфичности. 

Сегодня, если в лаборатории вводится ПЦР-анализ, диагносты рассчитывают на ускорение исследования клинических образцов без предварительного обогащения и, в то же время, возможность проведения специфической дифференциации между близкородственными видами или подтипами. В то время как потенциал ПЦР-методов в выполнении этих требовательных критериев не вызывает сомнений, часто возникает необходимость в критической оценке предложенной методологии не только на случай очевидного провала или неэффективности, но также и для оптимизации определенных параметров для дальнейшего повышения эффективности или снижения затрат.

Выбор таргетной последовательности нуклеотидов

Выбор области генома для амплификации определяет специфичность детекции с самого начала. Очевидно, что необходимо подобрать характеристику геномного сегмента ДНК соответствующего микроорганизма или группы видов, а информация о нуклеотидной последовательности практически незаменима для достижения комплементарности. В связи с постоянным увеличением общедоступной базы данных последовательностей ДНК, не является проблемой проверить предложенную последовательность на уровень гомологичности к другим организмам.

Чувствительность метода детекции связана с природой таргетного региона через эффективность связывания праймеров, которая определяет эффективность амплификации. Тот факт, что разные пары праймеров к одному и тому же гену могут проявлять 1000-кратные различия в чувствительности, иллюстрируют степень этой взаимосвязи. Аналогично, пары праймеров, фланкирующих разные участки генома, ожидаемо проявляют себя иначе в реакциях амплификации.

Поскольку длина продукта ПЦР обратно-пропорционально коррелирует с эффективностью амплификации, относительно короткие мишени не только облегчают получение высокой чувствительности при детекции, но и значительно лучше подходят для проведения количественного ПЦР-анализа. Кроме того, относительно короткие участки генома могут оставаться невредимыми в условиях умеренной деградации ДНК, тем самым делая детекцию более обильной и менее зависимой от использования образцов со свежим материалом. Таким образом существует определенный консенсус об оптимальном размере в 100-300 пн фрагментов ПЦР для детекции.

В отличие от методов детекции, применяемых в 1980-х и в начале 1990-х годов и основаных на случайном выборе таргетных последовательностей, сейчас подавляющее большинство используемых таргетов хорошо охарактеризованы. 

Рибосомные РНК гены

Регион генов рибосомных (р)РНК стал наиболее известной мишенью в детекции микроорганизмов. Около 50% от всех исследований проводятся на основе последовательностей генов рРНК, то есть рДНК. Такая популярность обычно связана с тем, что этот регион представлен универсальной смесью высококонсервативных и средне- и высоковариабельных сегментов. Более того, практически для всех микроорганизмов, встречающихся в ветеринарной и медицинской практике, известны последовательности генов рРНК.
Строение рРНК оперона у бактерий схематично представлена на Рис.1 и состоит из трех последовательностей генов и двух спейсерных участков.

Рис. 1. Структурная организация генов рибосомной РНК бактерий.

Благодаря своему размеру примерно в 1500 пн ген 16S рРНК является наиболее описанной частью оперона с доступными в базе данных GenBank® более чем 33’000 последовательностями только бактериального происхождения. Многие исследования по генетическому родству с последующим построением филогенетических деревьев проводятся с помощью анализа последовательностей области 16S. Широкая система диагностики на основе амплификации гена 16S рРНК была предложена Greisen et al. для дифференциации многих патогенных бактерий, включая виды Campylobacter, Lactococcus lactis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus и Streptococcus agalactiae. ПЦР систему детекции на основе 16S рРНК таргетной последовательности также используют для выявления Campylobacter, Leptospira или стрептококков, а также дифференциации между видами хламидий, микобактерий, микоплазм или для идентификации Clostridium perfringens и Yersinia enterocolitica.
Однако, следует отметить, что выявление и дифференциация на основе 16S рРНК может осложняться значительной внутривидовой гетерологией как для Riemerella anatipestifer, или высокой гомологией между родственными видами, например, Mycoplasma bovis/Mycoplasma agalactiae и Bacillus anthracis/Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis.
Ген большой субъединицы рибосомы, 23S рДНК, используется для диагностики реже, возможно в связи с его большими размерами. Количество полных последовательностей бактериальных генов 23S рДНК доступных в базах данных до сих пор очень мала по сравнению с 16S. Однако, принимая во внимание известную на сегодня степень вариабельности последовательности, эта геномная область, вероятно, является весьма перспективной в дифференциации видов. Существуют примеры использования последовательностей 23S рРНК в качестве таргетного региона для идентификации видов, в том числе для кампилобактер и хламидий.
Межгенный спейсер 16S-23S (или внутренний транскрипционный спейсер), который расположен между двумя главными генами рибосомной рРНК, может быть перспективной альтернативной мишенью. Кроме вариации последовательности, именно вариация размера делает данный сегмент пригодным для идентификации и дифференциации. Было установлено, что длина спейсера варьирует между 60 пн для Thermoproteus tenax и 1529 пн для Bartonella elizabethae. В результате систематического исследования, Scheinert et al. смогли различить 55 бактериальных видов, 18 из которых были образцами клостридий и 15 –микоплазмы, на основе длины ПЦР-амплифицированного спейсера 16S – 23S. Существуют методики для видов Campylobacter, хламидий, Clostridium difficile, Cryptococcus neoformans, видов Listeria, микобактерий, микоплазм, Pasteurella multocida, видов Pseudomonas, стрептококков, и стафилококков.
Хотя приведенные примеры четко иллюстрируют широкие возможности ПЦР-анализов на основе рДНК, пригодность любых других методик необходимо исследовать сначала линейными последовательностями, поскольку отсутствие достаточной вариабельности последовательности в зоне оперона может помешать созданию родо- или видоспецифических методик с определенными группами микроорганизмов. Более того, диагностический потенциал этого таргетного региона обычно недостаточен при внутривидовой дифференциации. Если изолятов дифференцируют в медицинских целях, например с серотипом или факторами вирулентности, целесообразнее использовать другие таргетные последовательности.

Гены белков

Многие ПЦР-методы, нацеленные на гены белков, были разработаны в попытке генетически повторить стандартные методы типирования на основе фенотипических признаков, как, например, серологическая реактивность, ферментативная или токсическая активность. В отличие от методов амплификации рДНК, они обычно разрабатываются специально для определенного микробиологического вида или для малой группы родственных организмов. Единственным значительным исключением являются методы, основанные на генах конститутивных белков, например, фактор элонгации EF-Tu, ферменты репарации ДНК, ДНК-связывающие белки и др., которые присутствуют во всех живых организмах и чьи последовательности филогенетически взаимосвязаны похожим к рРНК генов образом.
Существует широкое разнообразие последовательностей, кодирующих белки используемых в диагностических целях. Гены токсинов обычно используют в качестве таргетных, поскольку во многих случаях они были в числе первых генов, клонированных из соответствующих микроорганизмов, поэтому они обычно хорошо описаны. Неудивительно, что ПЦР-анализы для токсигенных бактерий, таких как Clostridium perfringens, Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella/Mannheimia hemolytica, и Actinobacillus pleuropneumoniae, созданы на базе этой категории генов. Другими генами, которые часто используются как таргетные, являются гены поверхностных антигенов или белки наружной мембраны, которые связывают с детекцией Actinobacillus pleuropneumoniae  кампилобактеров, хламидий, свиных микоплазм, Pasteurella multocida, и бруцелл. Кроме того, есть данные об использовании в ПЦР-анализах генов, кодирующих клеточные ферменты, основные транспортеры , ферменты репарации ДНК, белки теплового шока, факторы инвазии и различные факторы вирулентности.
Кроме упомянутой выше потенциальной возможности точной настройки специфичности детекции, наиболее явным преимуществом использования ПЦР-анализа на основе генов белков является наличие сопутствующей информации о токсинах, поверхностных антигенах или других маркерах вирулентности, поскольку эти факторы должны быть прямо вовлечены в патогенез. В этом отношении, такие анализы предоставляют больше информации об определенном микроорганизме, чем просто подтверждение его наличия в образце.

Повторяющиеся элементы

Некоторые микроорганизмы имеют повторяющиеся последовательности или вставные элементы. Поскольку эти сегменты имеются в нескольких копиях, то логичным является идея об использовании их в качестве мишеней. И действительно, это является благоприятной предпосылкой для развития высокочувствительных методов детекции. Предел обнаружения определенного микробактериального генома был установлен в результате применения последовательность-специфического захвата ДНК перед амплификацией.

Эффективность реакции амплификации
Ранние, Средние и поздние циклы

ПЦР амплификация ДНК базируется на циклической ферментативной реакции, в которой продукты (ампликоны) предыдущего цикла используются как субстрат для следующего цикла. Таким образом, теоретически, количество таргетных молекул должно вырастать експонециально, то есть удваиваться после каждого цикла. Эффективность реакции на практике не равна 100% и известно, что на самом деле амплификационные кривые отклоняются от экспоненциальной формы. Путь продуктов амплификации ДНК в течение 30 циклов при идеальной и реальной ПЦР показано на рис. 2. Степень отклонения от теоретического выхода продукта определяется эффективностью амплификации, которую можно примерно оценить по формуле:
Y = (1 + ε)ⁿ
где, Y – это выход амплификации (выражается коэффициентом количества молекул продуктов ПЦР и начальным количеством таргетных молекул), n – количество циклов, а ε – средняя эффективность всех циклов при 0 ≤ ε ≤ 1.


Рис. 2. Накопление продукта амплификации в ходе ПЦР анализа. Пунктирная линия соответствует идеальной кинетике синтеза ДНК (эффективность ε 1), а кривая показывает ход реальной ПЦР с ε < 1.

Эффективность реакции может, в принципе, иметь разное значение в каждом цикле. Параметры, влияющие на ε включают концентрацию ДНК полимеразы, dNTPs, MgCl₂, ДНК матрицы, праймеров, температуру денатурации, отжига и синтеза цепи, количество циклов, время линейного измерения, а также наличие ингибиторов и фоновой ДНК.
В первых нескольких циклах, когда доступно относительно небольшое количество молекул матрицы ДНК, праймеры преимущественно выполняют роль скрининг-зондов, которые гибридизируются независимо к комплементарным сайтам. Более того, часто не придают значения тому, что во время первого цикла генерируются цепи ДНК длиннее межпраймерного сегмента, количество которых растет арифметически в следующих циклах. Ситуация меняется в средних циклах, когда больше амплифицированных продуктов (правильного размера) с имеющимися сайтами терминального отжига, и праймеры меняют свою роль на векторы амплификации.
В зависимости от выхода продуктов амплификации, обычно ПЦР сначала носит экспоненциальный характер, затем проходит через квазилинейную фазу и наконец достигает плато. Эффект плато является результатом заметного изменения общего баланса массы в пользу продукта реакции. За достижение эффекта плато отвечает целый комплекс признаков, а не единственный фактор или параметр, поскольку повторное добавление предположительно истощенных реагентов (dNTP, праймеры, ДНК полимераза, MgCl₂) не вызывает повышения эффективности реакции.
Поскольку существует естественный предел концентраций продуктов порядка 10^-7 M, когда количество аккумулированных ампликонов уже не может увеличиться существенно, нет смысла проводить следующие циклы, поскольку конечный выход продуктов не увеличится. Напротив, активность 5′-3′ экзонуклеазы ДНК полимеразы может вызвать измеряемые потери продукта в случае, когда реакцию продолжают после квазилинейной фазы.

Факторы, влияющие на кинетику и выход амплификации ДНК
Отношение Праймер-матрица

В процессе реакции баланс массы между партнерами реакции меняется после каждого цикла. Ключевым параметром в этой динамичной системе является количество амплифицированного продукта. Поскольку его количество увеличивается с каждым циклом, постоянно уменьшается эффективность реакции. При использовании непрерывной математической модели на основе закона массового действия, Schnell и Mendoza показали, что эффективность реакции может достигать около 100% только тогда, когда в системе очень мало продукта. В ходе реакции до момента, когда концентрация исходного ДНК (матрица dNTP праймеров) и продукта амплификации становится одинаковой, эффективность падает до 50% перед тем как достичь нуля перед насыщением системы в фазе плато (см. Рис. 3). Снижение соотношения праймер-матрица на поздних циклах также способствует самоотжигу ампликонов, что приводит к снижению количества свободных сайтов связывания праймера.
Другим эффектом повышения концентрации продукта является снижение эффективности денатурации дуплекса. Концентрация таргетной ДНК обычно составляет от 103 до 106 копий в начале и может увеличиваться до 1012 после около 40 циклов. Однако, температура плавления (Tm) ДНК дуплекса поднимается при высокой концентрации, а эффект измеряют по концентрации продукта, соответствующей фазе плато ПЦР.
Описанные выше параметры могут помочь объяснить почему ПЦР методы амплификации часто не работают в случаях, когда к реакционной смеси добавляют слишком много ДНК образца и данную проблему обычно решают разведением образца. Избежать неэффективной денатурации можно строго соблюдая протоколы и обеспечивая достаточно высокую температуру денатурации (94°-95°C) и время денатурации от 30 до 60 сек. Сведения о кинетических характеристиках фазы плато также помогают понять, что продолжение протоколов амплификации до более чем 40-45 циклов увеличивает возможность возникновения неспецифической амплификации.

Эффективность отжига праймеров

Оптимальная конструкция праймеров направлена на достижение как высокой специфичности (например, исключительная амплификация выбранной мишени), так и эффективности (например, высокий выход амплифицированной ДНК через выбор термодинамически эффективных сайтов связывания праймера), хотя часто приходится принимать компромиссные решения для достижения универсальности и практичности.

Рис. 3. Изменение эффективности ε ПЦР в виде функции [ДНК’], отношение амплифицированного продукта к исходной концентрации матрицы. Точка p, где [ДНК’] 1, соответствует эффективности ε 0,5.

Специфичность амплификации в основном определяется температурой отжига (T_отж) и, в меньшей степени, длиной праймера. T_отж анализа ПЦР часто устанавливается в пределах нескольких градусов от температуры плавления праймера T_пл. Для отдельной реакции оптимальную T_отж можно рассчитать по формуле:

T_отж = 0.3 T_{пл-праймера} + 0.7 T_{пл-продукта} – 14.9

Где средняя точка температуры плавления праймера – это T_{пл-праймера} = 0.5 (T_{пл-праймер1} + T_{пл-праймер2}), а температура плавления продукта – это
T_{пл-продукта} = 81.5 + 0.41 (% G + C) + 16.6 log [K⁺] – 675/L
(где% G + C, молярная концентрация гуанозин-плюс-цитозин, [K+], молярная концентрация ионов калия; L – длина ампликона в парах нуколеотидов). Добавление сорастворителей, таких как диметил сульфоксид и формамид, позволяет проводить реакцию при более низких T_отж и в отдельных случаях повышает как выход, так и специфичность.
Если все другие условия являются оптимальными, повышение T_отж может увеличить выход, поскольку при таких условиях уменьшаются несоответствия между праймером и матрицей и подавляется ко-синтез неспецифических продуктов. Пример такого влияния T_отж на специфичность показан на рис. 4
Для идентификации микробных видов, родов, или серотипов необходимо учитывать ожидаемую внутриродовую и внутривидовую изменчивость в регионе таргетной последовательности. Учитывая это, методику амплификации необходимо проводить при субоптимальной T_отж ценой специфичности детекции. Если степень вариабельности таргетной последовательности хорошо известна, применение ряда дегенеративных праймеров может решить диагностическую проблему. Несмотря на то, что была показана пригодность таких систем, их необходимо тщательно проверить перед тем, как ввести в рутинную диагностику, поскольку их производительность трудно предсказать.
Оптимальная длина праймера варьирует между 18 и 24 нуклеотидами. Базовый состав олигонуклеотидов праймеров должен быть как можно более сбалансированный, например, 50% содержания гуанозин-плюс-цитозин (G+C) ведет к значениям T_пл в пределах 56-62°C, что является благоприятным для отжига. Для обеспечения эффективной амплификации для определенной пары праймеров, отклонение содержания G+C и значение T_пл должно быть в пределах всего нескольких единиц.
На начальных этапах ПЦР неспецифическое связывание праймеров и образование димеров праймеров может вызвать трудности, поскольку частота совпадения праймера и матрицы еще низкая. Более того, так называемые спорадические артефакты могут возникать в результате наличия одноцепочечных фрагментов ДНК, которые частично удлиняются из зоны присоединения, и отжигаются к гомологичной мишени в другом месте генома, ведет к появлению неспецифического продукта. Известно, что вторичные структуры матрицы (петли, шпильки) также вызывают появление аберрантных продуктов в результате перескакивания ДНК полимеразы, то есть когда неамплифицированными остаются нелинейные сегменты.
Эффективным способом решения проблемы неспецифического связывания праймера с матрицей является тачдаун ПЦР, когда начальную температуру отжига с каждым циклом постепенно поднимают пока она не достигает оптимального значения. Однако, в случае низкого количества копий таргетной последовательности образца, часто помогает проведение нескольких первых циклов при T_отж ниже, чем оптимум и, таким образом, допуская одновременный синтез определенного количества неспецифического продукта, а затем повысить T_отж до ее оптимума для дальнейших циклов (тачап ПЦР). Показано, что длительное повышение ΔT_отж на 1°C на каждый цикл приводит к увеличению выхода продукта в отличие от протокола с использованием постоянной T_отж.
Как можно ожидать, фаза плато демонстрирует все больше неблагоприятных условий для эффективного связывания праймеров. Хотя концентрация праймеров лишь немного ниже, чем в начале ПЦР, из-за наличия избытка в реакционной смеси, сильно сниженное соотношение праймер-матрица (от 2×10⁷ до 19 после 10⁶-кратной апмлификации) приводит к замедлению формирования комплекса праймер-матрица и, наконец, к насыщению.
Вероятность образования димеров праймеров можно снизить в процессе выбора праймера, например, исключив последовательности праймеров, комплементарные друг к другу, в частности на 3′-концах.


Рисунок. 4. Влияние температуры отжига на специфичность амплификации. Из двух образцов птичьего помета экстрагировали ДНК и исследовали с помощью вложенной ПЦР на Chlamydia psittaci. Температура отжига второй амплификации варьировала между 50-60°C. Дорожка 1, образец A; дорожка 2, образец B; полоса 3, контроль реагентов; дорожка 4, ДНК штамма C1 (Chlamydia psittaci) и дорожка 5, маркер размера ДНК (100 пн). Заметим, что правильный продукт амплификации на дорожке 4 находится на 390 пн, тогда как неспецифические полосы в дорожках 1 и 2 при 50°, 54° и 57°C находятся вблизи 400 пн. В этом случае проведение ПЦР-анализа при субоптимальный температуре отжига приводит к ложно-положительным результатам.

Соотношение фермент-матрица

Количество ДНК полимеразы, имеющейся в реакции, также может быть лимитирующим фактором, который может поспособствовать снижению эффективности. Schnell и Mendoza выделили соотношение свободных (несвязанных) ферментов к общим как наиболее важный параметр, определяющий эффективность ε при i циклов и предложили математическое отношение, которое приведено в формуле:
ɛ_i = 1 – [ET_i]/([E_i]-[ET_i])
где [E_i] – это концентрация ДНК полимеразы, а [ET_i] – это концентрация комплекса фермент-матрица на i-том цикле.
На начальных циклах возникает большой избыток молекул фермента по сравнению с матрицей ДНК, обычно порядка 10⁵, их соотношение будет равно 1 после 10⁶-кратной амплификации. В результате наличия большего количества молекул продукта чем полимеразы возникает снижение выхода на каждом цикле в линейной фазе и фазе плато. В таких условиях становится невозможным присоединение одной молекулы фермента к одному комплексу праймер-матрица на этапе удлинения, вследствие чего уменьшается количество генерируемых в каждом цикле ампликонов (полной длины), и синтезируется больше неспецифических коротких продуктов. Путем увеличения этапа удлинения в более поздних циклах или повышения концентрации фермента в реакционной смеси возможно частично компенсировать описаное снижение эффективности. Впрочем, содержание ферментов следует оптимизировать эмпирически, поскольку их избыток часто стимулирует косинтез неспецифических продуктов.
Несмотря на то, что термостабильность коммерчески доступных ДНК полимераз в течение последних десяти лет постоянно улучшается существует умеренное снижение их активности в поздних циклах. Это является еще одной причиной не рекомендовать большое количество циклов в ПЦР детекции: доказано, что для большинства программ достаточно 30-35 циклов.

Методологические приемы для улучшения результатов амплификационных анализов

Применяя ПЦР анализ к клиническим образцам, содержащим лишь несколько клеток патогена, необходимо помнить об особых кинетических условиях, которые превалируют в такой реакционной смеси. В начале реакции может иметься малое количество копий (от 1 до 100) таргетной последовательности и крайне важный шаг отжига праймера трудно контролировать. Из-за этого могут понадобиться дополнительные меры для обеспечения специфичности связывания олигонуклеотидов праймеров с как можно большим количеством мишеней и, в то же время, во избежание неспецифического связывания синтезированной ДНК.

ПЦР с горячим стартом

Основная идея ПЦР с горячим стартом заключается в снижении неспецифической амплификации на начальной фазе путем активации фермента сразу перед первым этапом связывания праймера. Этот подход разработан для предупреждения формирования димеров праймеров, миспрайминга и спонтанной инициации синтеза цепи ДНК, хотя большинство из этих процессов уже происходит при комнатной температуре между смешиванием реагентов и началом собственно ПЦР реакции. Наиболее распространенный вариант ПЦР с горячим стартом связан с применением термостабильной ДНК полимеразы, которая поставляется в активной форме и требует 10-ти минутного нагрева при 94°-96°C для активации. Многие протоколы «традиционного» ПЦР-анализа можно усовершенствовать в плане специфичности путем применения процедуры горячего старта и ее специальных реагентов.
Другой подход включает так называемые праймеры петли, несущие дополнительные 5′-концы, которые приводят к самоотжигу олигонуклеотидов или к олигомеризации при температуре окружающей среды. При нагревании реакционной смеси, праймеры линеаризируются только при повышенной температуре, таким образом инициируя горячий старт. Для повышения специфичности амплификации протокол начинают с шести тачап циклов, в которых T_отж постоянно повышается с 60° до 72°C. Условия горячего старта можно создать путем добавления коротких двухцепочечных фрагментов ДНК.

Вложенная ПЦР

Использование вложенной ПЦР часто может позволить решить проблемы детекции, связанные с клиническими образцами тканей, содержащих низкое количество копий мишеней против высокого фонового количества ДНК тканей хозяина и ингибиторов ДНК полимеразы. Типичный протокол необходимо начинать с первой серии амплификации (30-35 циклов), используя набор внешних праймеров, а затем использовать маленькую аликвоту продукта первого серии во второй серии со свежими реагентами и использованием пары внутренних праймеров. Такой подход оказался более удачным чем разведение и повторная амплификация с теми же праймерами. Часто позиция внутренних праймеров является определяющим фактором чувствительности и специфичности анализа.
Теоретически, даже при оптимальных условиях, любая ПЦР достигает природного плато, поэтому не следует ожидать увеличения выхода (т.е. чувствительности) от повторной амплификации разбавленного продукта предыдущей реакции. Однако, существует множество примеров, когда необходимая чувствительность детекции была достигнута только благодаря вложенной ПЦР, в основном за счет того, что многие методики ПЦР детекции оптимизированы не полностью. Кроме того, клинические и полевые образцы часто содержат ингибиторы, которые препятствуют высокой эффективности первой ПЦР. В таких обстоятельствах, вторая серия амплификации может существенно все изменить.
С кинетической точки зрения, вторую ПЦР можно рассматривать как продолжение первой реакции с сильно пониженным количеством продукта – мера, которая может повысить эффективность и выход.
В диагностических целях, вложенная ПЦР является мощным инструментом для дифференциации, из-за возможности выбора сайтов связывания внешних праймеров в геномном сегменте, который является общим для группы организмов, например, семьи, рода, вида и помещать внутренние праймеры в сайты, которые являются специфическими для отдельного вида, серовара, или биоваров. В этой области применения вложенная ПЦР может обеспечить важную информацию для эпидемиологии и таксономии. Другим преимуществом является сведение к минимуму повторной амплификации неспецифических продуктов с первой серии в результате использования других праймеров во второй серии.
Что касается рутинной диагностики, существуют определенные предостережения относительно использования вложенной ПЦР из-за ее особой уязвимости к выносу продукта. Тот факт, что многие лаборатории используют протоколы вложенной ПЦР в рутинных целях также указывает на ее практичность, но этот метод остается сферой исключительной компетенции для более опытных или специализированных лабораторий.

Мультиплексная ПЦР

Возможность применения нескольких пар праймеров, каждая из которых имеет определенную специфичность, в одной реакции позволяет предоставить многомерную перспективу диагностическому потенциалу ПЦР. Такая процедура позволяет проводить спонтанную детекцию двух или более различных микробиологических агентов в одном образце и включать внутренние контроли. Поскольку мультиплексная ПЦР включает гораздо более комплексную реакционную систему, чем нормальный симплексный режим, ее динамику значительно труднее предсказать, а значит ее можно применять только после всесторонних испытаний.
Пользователи должны знать, что, в принципе, каждая из этих параллельных реакций амплификации протекает с собственной кинетикой и эффективностью, поэтому результатом будет разная чувствительность и специфичность для каждой мишени. Даже в относительно простой конкурентной системе ПЦР для относительной количественной оценки, когда ДНК образца и матрица внутреннего стандарта имеют идентичные сайты связывания праймеров, нет гарантии того, что оба компонента амплифицируются с одинаковой эффективностью. Хотя мультиплексная ПЦР является очень комплексным анализом, включающим различные таргетные последовательности различных организмов, существуют два общезначимых вывода, которые вытекают из опыта проведения конкурентной ПЦР:
– существует обратно-экспоненциальное отношение между размером матрицы и эффективностью амплификации;
– образование гетеродуплекса между различными ампликонами становится более вероятным, когда две или более таргетные последовательности имеют общие гомологичные сегменты.
Кроме того, праймеры могут взаимодействовать друг с другом, таким образом ухудшая результативность анализа. Недавнее исследование Bercovich et al. установило, что относительное количество праймеров имеет значительное влияние на выход при амплификации дуплекса. Аналогично, оптимальная T_отж дуплексного анализа необязательно будет равняться арифметическому среднему значению температуры отжига каждого отдельного симплексного анализа.
В результате систематических исследований экспериментальных параметров мультиплексной ПЦР Henegariu et al. было предложено основной пошаговый протокол оптимизации. Авторы выделили ключевую роль сбалансированности относительных концентраций между парами праймеров, а также между хлоридом магния и dNTP. Для полного синтеза цепи необходимо больше времени по сравнению с симплексной ПЦР, поэтому этап экстензии должен быть длиннее. Другими важными параметрами являются T_отж и концентрация реакционного буфера.
Количество систем детекции мультиплексной ПЦР микробиологических агентов невелико.
С целью детектировать бактериальные агенты, связанные с менингитом, применяли полувложенную мультиплексную стратегию для одновременной детекции Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, и Listeria monocytogenes в спинномозговой жидкости. Первая серия амплификации включает универсальные эубактериальные праймеры, которые связываются с консервативными сегментами гена 16S рРНК, один из которых заменяется набором видоспецифических праймеров во второй (мультиплексной) ПЦР.
Процедура скрининга респираторных образцов была разработана Tong et al., которые использовали праймеры от гена адгезинов Р1 из Mycoplasma pneumoniae и гены ompA из Chlamydia pneumoniae и C.psittaci для детекции этих патогенов. В этом случае оптимизированные условия мультиплексной ПЦР сильно не отличались от индивидуальных анализов.
Для дифференциации трех видов хламидий, например, C. pneumoniae, C. psittaci, и C. trachomatis, был амплифицирован родоспецифичный сегмент гена 16S рРНК в первой серии с последующей мультплексной вложенной амплификацией. Этот метод был рекомендован для клинических образцов человека и птиц, таких как мазки из горла, ткани легких и фекалии. Для тех же видов сообщается о другом мультиплексном анализе с использованием гена 16S рРНК и области спейсера 16S-23S в качестве мишени и в основе которого лежит тачдаун ПЦР с активацией фермента в определенное время. Эта методология была выбрана для обеспечения высокой специфичности. Идентификацию легко можно провести в соответствии с размером ампликона, а границы детекции были ниже 0.1 единиц формирования включений.
Feng и Monday описали мультиплексную методику детекции и дифференциации энтерогеморрагических серотипов E. coli. Праймеры были размещены в пяти областях гена (uidA, eaeA, stx1, stx2, ehxA), а результаты соответствовали принятой классификации генотипов.
Было показано, что группа птичьих микоплазм, то есть Mycoplasma gallisepticum, M.synoviae, M.iowae, и M.meleagridis, детектируются одновременно мультиплексной амплификацией ненормированных видоспецифических таргетных последовательностей.
Пригодность ПЦР при генотипировании Clostridium perfringens была продемонстрирована Meer и Songer, которые разработали мультиплексный анализ, использовав в качестве мишеней гены, кодирующие основные токисны, такие как α, β, ε, ι, и энтеротоксин. Поскольку генотипы, которые были определены с помощью этого метода совпали с результатами фенотипического анализа в 99% всех случаев, ПЦР подход оказывается более простой и быстрой альтернативой традиционным методам.
Восемь генотипов Trichinella, некоторые из которых представляли отдельные виды, были дифференцированы с помощью ПЦР с использованием 5 пар праймеров, локализующихся в генах рибосомной рРНК и области спейсера. Размер ампликона (ампликонов) был характерен для каждого типа.
Несомненно спрос на мультиплексную ПЦР будет в дальнейшем расти не только из-за потенциала снижения финансовых затрат и повышения производительности, но также в свете современных событий в области технологий анализа ДНК, которые обеспечат новыми мощными системами детекции.

Практическое применение рутинного ПЦР в диагностической лаборатории

Каждый раз когда вводится новая методика ПЦР детекции, необходимо провести проверку полученных результатов. Идентичность определенного продукта амплификации необходимо подтвердить такими тестами как гибридизация Саузерн блоттингом с использованием специфических зондов, рестрикционный анализ, дальнейшая вложенная ПЦР или ДНК секвенирование.
Как и любой новый диагностический инструмент, детекционный ПЦР анализ требует тщательной проверки перед тем как начать применять его в качестве официального метода. В идеале главным эталоном должна быть культура, которую часто называют золотым стандартом, так же как и ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA) с определенным антигеном. Такой вариант подходит для известных и хорошо исследованных бактериальных агентов, таких как сальмонелла, E.coli, кампилобактеров, или листериоза, но существуют серьезные препятствия при валидации в других случаях. Например, сравнительное исследование ПЦР детекции животных хламидий (таких как птичьи и бычьи C.psittaci, свиные C.trachomatis) часто остается неполным, поскольку многие штаммы не растут в культуре. Аналогично, любой тест ELISA на эти антигены столкнется с той же дилеммой, если провести проверку. Не существует возможности проверить более эффективную методологию ПЦР традиционными методами, которые очевидно уступают ПЦР в чувствительности и специфичности. В таких случаях следует применять прагматичный подход, а ПЦР следует принять как пригодный на данный момент метод, при условии если существуют комплексные доказательства специфичности и чувствительности детекции.
Как только метод ПЦР вводится и используется в диагностических лабораториях, необходимо решить что делать с полученными данными и их последствиями.
Высокая чувствительность ПЦР неизбежно приводит к большему количеству положительных образцов по сравнению с традиционными методами. Как правило, на детекцию агенту необходимо больше времени в ходе протекания инфекции. То, что наличие патогена можно подтвердить еще в инкубационном периоде, то есть еще до начала иммунного ответа хозяина и появления клинических симптомов, является весомым преимуществом и позволяет проводить необходимые меры контроля на ранних этапах.
Аналогично, более вероятным будет идентификация патогена в животном организме при бессимптомном протекании и распространении вследствие высокой чувствительности детекции ПЦР. Это позволяет следить за эпидемиологическим статусом стада более тщательно. Поскольку высокая пропускная способность достигается микротитровальными планшетами на 96 лунок или других форматов, ПЦР анализ представляет собой мощный инструмент диагностики стада.
Тот факт, что с помощью ПЦР анализа можно детектировать ДНК нежизнеспособных или мертвых микробных клеток часто считается недостатком метода. Довольно трудно дать однозначный ответ на вопрос есть ли такие результаты ложноположительными. Конечно, необходимо быть бдительным при интерпретации результатов ПЦР анализа образцов от животных, проходящих терапию антибиотиками, поскольку они могут быть положительными из-за некоторых остатков мертвых клеток или ДНК инфекционного агента, которые не имеют клинического значения. С другой стороны, идентификация микроорганизмов с помощью ПЦР в экскрементах периодических распространителей, даже если они нежизнеспособны или неспособны к культивированию, может предоставить важные доказательства наличия патогена, который остался бы невыявленным при использовании других методов. Повторный положительный результат ПЦР на фоне терапии антибиотиками и/или серологической нечувствительности и бактериологической стерильности может означать хроничность или несоответствие лечения.
Одним из главных последствий для эпидемиологии, что следует из увеличения доступности диагностических данных на основе ПЦР, может быть осознание того, что наличие патогена оказалась больше чем считалось ранее и он остается в определенном количестве в очевидно здоровом хозяине. Тот факт, что одно наличие определенного патогена не всегда означает наличие клинической картины заболевания не является новым для опытных диагностов и практикующих врачей, но о нем редко вспоминают в пособиях. Поэтому, увеличение количества эпидемиологических данных, полученных с помощью анализа ПЦР, поможет повторить (или подтвердить) хорошо известный тезис о том, что наличие патогена является необходимым, но недостаточным условием для развития болезни. Это также углубит понимание между практикующими врачами, ветеринарными инспекторами, лабораторными ветеринарами, традиционными и молекулярными диагностами, если последние в дальнейшем распространят эту информацию.
В качестве важного ограничения, необходимо подчеркнуть, что патогенный потенциал определенного микробного штамма не охватывается должным образом большинством современных ПЦР тестов, которые только показывают наличие одного гена или таргетной последовательности. Современные и будущие исследования, направленные на новое поколение анализов для одновременной идентификации целого комплекса патогенных факторов, связанных с микробными агентами, животными хозяевами и окружающей средой, наверное предоставят более удовлетворительные ответы.