Предварительная обработка проб для ПЦР

Трудности работы с биологическим материалом для ПЦР


Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является мощным и быстрым методом диагностики, который используется для микробиологических инфекций и других генетических заболеваний, а также для выявления микроорганизмов в пробах из окружающей среды и еды. Эффективность диагностической ПЦР ограничена наличием ингибиторных веществ в биологических образцах, которые понижают или блокируют способность к амплификации ПЦР в сравнении с чистыми растворами нуклеиновых кислот .

Наличие веществ, мешающих амплификации, будет прямо влиять на качество диагностики с помощью ПЦР

Наличие веществ, мешающих амплификации, будет прямо влиять на качество диагностики с помощью ПЦР и, в частности, на чувствительность обнаружения. Некоторые ингибиторы могут кардинально препятствовать амплификации даже в очень незначительном количестве. Например, ПЦР смеси, содержащие широко используемую полимеразу Taq DNA, полностью подавляются при наличии объемной доли человеческой крови 0.004%. Поэтому, необходимо проводить обработку образцов перед ПЦР для обеспечения амплификации таргетных нуклеиновых кислот при наличии даже следовых количеств веществ, ингибирующих ПЦР. Для улучшения диагностической ПЦР с целью использования для рутинных анализов, обработка образца является ключевой для обеспечения надежности и общей эффективности метода. В целом, диагностическую ПЦР можно разделить на четыре шага:

  • отбор проб;
  • подготовка проб;
  • амплификация нуклеиновых кислот;
  • детекция ПЦР продуктов.

Предварительная обработка проб включает все шаги до выявления ПЦР продуктов. Таким образом, предварительная обработка включает составление реакционной смеси ПЦР, выбор ДНК полимеразы и усилителей амплификации.

Ингибиторы ПЦР

Ингибиторы ПЦР происходят либо от оригинальных образцов, либо от образцов, полученных в процессе пред-ПЦР подготовки, либо и то и другое. Механизмы действия ингибиторов разделены на следующие три категории:

  • деактивация термостабильной ДНК полимеразы;
  • деградация или захват нуклеиновых кислот;
  • препятствование на этапе лизиса клеток.

Не взирая на то, что было зарегистрировано большое количество биологических проб, вызывающих ингибирование ПЦР амплификации, природа и биохимические механизмы действия многих ингибиторов все еще остаются неясными.

Подходы к определению характеристик ингибиторов ПЦР

Действие ингибиторов ПЦР можно изучать либо, повышая концентрацию очищенной матрицы ДНК либо добавляя разные концентрации ПЦР-ингибиторных образцов, либо с помощью обоих способов. Повышение концентрации таргетной ДНК целесообразнее для преодоления действия ингибиторов (повреждение ДНК и/или обратное связывание с ДНК-связующим доменом ДНК полимеразы), тогда как добавление разных концентраций ингибиторных образцов является альтернативным подходом оценки силы действия ингибиторных образцов на амплификационную способность ПЦР. С другой стороны, изучения влияния ингибиторов на активность полимеризации ДНК полимеразы целесообразно для
— сравнения влияния разных ингибиторов;
— проведения кинетического анализа ДНК полимеразы в присутствии и отсутствии ингибиторов;
— оценки влияния добавления веществ, которые ослабляют ингибирование, таких как бычий сывороточный альбумин (БСА).
Недавнее внедрение термоциклеров с детекцией аккумуляции продуктов ПЦР в реальном времени дает возможность изучить количественный эффект ингибиторов более тщательно. Эти инструменты можно использовать для изучения эффективности ПЦР и/или для изучения эффективности, с которой ДНК полимераза синтезирует ДНК при наличии или в отсутствии ингибиторов ПЦР.

Идентификация ингибиторов ПЦР

Ингибиторы ПЦР:
— соли желчных кислот,
— сложные полисахариды в фекалиях,
— коллаген в пищевых пробах,
— гемм в крови,
— гуминовые вещества в почве,
— протеиназы в молоке,
— мочевина в моче.
Термостабильная ДНК полимераза является, наверное, наиболее важной мишенью ПЦР-ингибиторных веществ. В недавних исследованиях, с помощью различных хроматографических процедур, гемоглобин, иммуноглобулин G (IgG), и лактоферин были идентифицированы как три основных ингибитора ПЦР в человеческой крови. Обнаружено, что механизм IgG ингибирования ПЦР зависит от его возможности взаимодействовать с одноцепочечной ДНК. Кроме того, эта взаимосвязь повышается при нагревании ДНК вместе с IgG. Тестирование разных специфических клонов IgG показало, что блокировка амплификации путем взаимодействия с одноцепочечной целевой ДНК является главным эффектом иммуноглобулинов G. Таким образом, в случае с образцами крови, не рекомендуется использовать кипячение в качестве метода подготовки образца или использование методики ПЦР с горячим стартом.

Гемоглобин и лактоферин являются основными ингибиторами ПЦР в эритроцитах и лейкоцитах, соответственно (5), и как гемоглобин, так и лактоферин содержат железо. Механизм ингибирования может быть связан со способностью этих белков освобождать ионы железа в ПЦР смесь. При исследовании ингибиторного действия железа было установлено, что оно препятствует синтезу ДНК. Кроме того, билирубин, соли желчных кислот и гемин, которые являются производными от гемоглобина, также имеют ПЦР-ингибиторные свойства. Было предложено, что гемм регулирует активность ДНК полимеразы и координирует синтез компонентов в гемоглобине в эритроидных клетках путем ингибирования по типу обратной связи (14). В том же исследовании было обнаружено, что гемин является конкурентным ингибитором с таргетной ДНК и неконкурентным ингибитором с нуклеотидами через прямое воздействие против ДНК полимеразы. В результате, характеристика ингибиторов ПЦР и подробные сведения об ингибиторных возможностях и механизмах являются важными предпосылками для развития более эффективных методов подготовки образцов, которые будут исключать необходимость обширной обработки биологических проб перед проведением диагностической ПЦР.

Подготовка образцов

Целью подготовки образцов является

  • исключение ПЦР-ингибиторных веществ, которые могут уменьшить способность к амплификации ДНК и эффективность амплификации;
  • увеличение концентрации целевых организмов до практического рабочего диапазона данной ПЦР методики;
  • уменьшение количества гетерогенных объемных образцов и получение гомогенных образцов для амплификации с целью обеспечения воспроизводимости и повторяемости теста.

Все эти факторы влияют на выбор метода подготовки пробы. Однако, многие методы подготовки проб являются трудоемкими, дорогостоящими и требующими много времени или же не удовлетворяют критериям необходимого качества матрицы. Поскольку подготовка проб является сложным шагом в диагностической ПЦР, было разработано большое разнообразие методов и все эти методы влияют на ПЦР анализ по-разному с точки зрения специфичности и чувствительности. Самые часто используемые методы подготовки проб можно разделить на четыре разные категории:

  • биохимические;
  • имунологические;
  • физические;
  • физиологические методы.

Список некоторых веществ, которые могут негативно повлиять на эффективность ПЦР, показан в Таблице 1.

Таблица 1. Методы подготовки образцов используемые для различных видов проб

Категория метода подготовки образца Подкатегория Метод подготовки образца
Образец
Биохимические Адсорбция Разделение на основе лектина Мясо говядины
Адсорбция белка Кровь
Экстракция ДНК Метод очистки ДНК Гемолитическая сыворотка
Литические методы Антикоагулянты крови
Иммунологические Адсорбция Иммуногенетический захват Кровь
Физические   Водные двухфазные системы Мягкий сыр
  Центрифугирование в растворе с градиентом плавучей плотности Фарш
  Центрифугирование Моча
  Растворение Кровь
  Фильтрация Молоко
Физиологические   Обогащение Мясо

Биохимические методы

Наиболее широко используемым биохимическим методом является экстракция ДНК. Доступно большое количество разных коммерческих наборов. Преимуществом экстрагирования ДНК является обеспечение гомогенными образцами высокого качества для амплификации. Большинство ингибиторов ПЦР удаляются, поскольку матрица обычно очищается и хранится в соответствующем буфере, например в Tris-EDTA (TE) буфере. Недостатком методов экстракции ДНК является то, что таргетный микроорганизм обычно необходимо предварительно обогатить в среде или на агаризированых чашках до экстракции. К тому же, большинство методов ДНК экстракции трудоемкие и дорогостоящие. Также может иметь место варьирование между группами после экстракции ДНК в отношении чистоты и концентрации матрицы.

Иммунологические методы

Эти методы в основном базируется на использовании магнитных шариков покрытых антителами. Поскольку используются антитела, это будет влиять на специфичность, и захваченными клетками будут содержащие соответствующий антиген. Специфичность методики ПЦР зависит как от используемого анализа ПЦР, так и от специфичности антител. В целом, после захвата антитела необходимо провести лизис или промывку образца (24), после чего можно использовать вирусы напрямую. В большинстве случаев эти методы увеличивают концентрацию таргетного организма. Гомогенность ПЦР образца может отличаться в зависимости от используемых после захвата шагов по его обработке, но обычно после этой обработки качество матрицы находится на соответствующем уровне. Поскольку часть специфичности зависит от самих антител, могут возникать ошибочно негативные результаты вследствие перекрестных реакций. Эта методология довольно дорогая, а также трудоемкая и отнимает много времени.

Физические методы

Существует большое количество физических методов, как например двухфазные водные системы, центрифугирование в растворе с градиентом плавучей плотности, центрифугирование, фильтрация и разведение. Эти методы зависят от физических свойств клеток-мишеней, например, плотность клеток и их размер. Двухфазные водные системы обеспечивают мягкий способ разделения ингибиторов ПЦР и клеток-мишеней между двумя несмешивающимися фазами. Например, система, основанная на полиэтилен гликоле (PEG) 4000 и декстране 40, была использована при методике ПЦР детекции для Helicobacter pylori в человеческих фекалиях. Зональное центрифугирование оказалось перспективным методом в случаях, когда необходима быстрая детекция. Градиентные среды, такие как Percoll (Pharmacia, Uppsala, Sweden) и BactXtractor (Quintes-sence Research AB, Bаlsta, Sweden), использовали для концентрирования организмов-мишеней и выведения ПЦР-ингибиторных веществ разной плотности. После этой обработки получают целые клетки, которые могут быть использованы в качестве пробы для ПЦР. Однородность образца может отличатся зависимо от вида матрицы биологического образца. Если компоненты матрицы образца имеют такую же плотность, как и клетки, то они могут подавить амплификацию ДНК. Преимуществом зонального центрифугирования является то, что организм-мишень концентрируется, что позволяет провести быструю детекцию. Кроме того, эти методы относительно удобны в обращении.

Физиологические методы

Эти методы основаны на росте бактерий и биосинтезе клеточных компонентов, то есть составляющие генома, цитоплазмы, и клеточной поверхности. Наращивание культуры можно проводить на бульоне для накопления бактерий или агаризированной среде в чашках Петри. Опять же, целью методов является обеспечение жизнеспособных клеток-мишеней в обнаруживаемой концентрации перед проведением ПЦР. Может быть использована селективная или неселективная агаризированная или обогащенная среда, а специфичность будет частично зависеть от характеристик среды. Качество матрицы, а также однородность пробы для ПЦР, может отличаться в плане наличия клеточных компонентов. К преимуществам этой методологии относятся его простота и низкая стоимость. Метод дает возможность получить живые клетки для использования в ПЦР без дальнейшего этапа лизиса. Однако следует помнить, что клетки содержат высокие концентрации макромолекул, что может оказывать влияние и смещать равновесие во многих биохимических реакциях, например ДНК полимеразы и ее свойства связывания ДНК матрицы с праймером. Таким образом, ДНК полимераза играет ключевую роль во время амплификации ДНК с точки зрения синтеза ДНК и противодействию ингибиторам ПЦР.

ДНК полимеразы

Первые ПЦР эксперименты проводили с неустойчивым к тепловому воздействию фрагментом ДНК полимеразы І Eschericia coli Кленова, которую нужно было восполнять перед каждым циклом. Использование термостабильной ДНК полимеразы из Thermus aquaticus (Taq) сильно облегчило ПЦР и увеличило специфичность. С высокой специфичной активностью, точностью и диапазоном температуры, Taq ДНК полимераза и ее производные стали и до сих пор остаются самыми широко используемыми энзимами в ПЦР. Термостабильная ДНК полимераза является ключевым компонентом в реакции амплификации, и любой фактор, препятствующий ферментативной активности, будет влиять на функциональные возможности амплификации. ДНК полимераза может распадаться, денатурировать или может уменьшаться ее ферментативная активность вследствие действия многих веществ, присутствующих в биологических пробах.

Сейчас в продаже есть ряд ДНК полимераз из других организмов. Примерами часто используемых ДНК полимераз является rTth и Tth, выделенные из Thermus thermophilus, DyNazyme выделенная из T. brockianus,  Platinum Taq со встроенным горячим стартом, обе выделены из T. aquaticus. Эти полимеразы проявляют различные свойства относительно сопротивления к разным компонентам в биологических образцах и эффективности в присутствии этих компонентов. Выбор полимеразы влияет на эффективность нескольких ПЦР-приложений, таких как генотипирование по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и амплификация фрагментов ДНК случайными праймерами (RAPD), мультиплексная ПЦР, дифференциальный дисплей с обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR), и ПЦР с заготовленными липкими концами (autosticky PCR). Недавние исследования показали, что разные полимеразы имеют разную восприимчивость к ингибиторам ПЦР. Таким образом, подавление ПЦР компонентами биологических проб можно уменьшить или исключить выбором подходящей термостабильной ДНК полимеразы без необходимости длительной обработки образцов перед ПЦР.
Выбор ДНК полимеразы определяется некоторыми факторами, относящимися к применению. Уровень сопротивления ДНК полимеразы к ингибиторам ПЦР может определяться внутренними факторами, такими как техника очистки энзима и состав реакционного буфера, а также его производство из естественного или рекомбинантного штамма. Кроме того, методика подготовки образца и наличие следовых количеств реагентов экстракции в очищенном образце может повлиять на эффективность экстракции и чувствительность ПЦР. Taq ДНК полимераза из разных коммерческих источников в разной степени ингибируется гуминовыми веществами в экстрактах почвы. Источник Taq ДНК полимеразы на этапе ПЦР также влияет на характер полос в результате дифференциального дисплея. Различная эффективность ДНК полимераз при ПЦР с ко-амплификацией также обусловлена действием солей. Полимераза Tth сохраняет как ДНК- так и РНК-зависимую активность ДНК полимеразы в присутствии 5% (v/v) фенола, в то время как следовое количество фенола ингибирует Taq ДНК полимеразу. Несколько исследований оценили эффективность и свойства разных ДНК полимераз в отношении разных ПЦР образцов, включая клинические пробы, кровь, фекалии и клеточный материал.

Таблица 2. Сравнение эффективности различных методов пред-ПЦР подготовки

Категория методов подготовки образцов Продукт подготовки образцов Однородность продукта
Концентрация продукта Выведение
ПЦР ингибиторов

Необходимое
время
Затраты
Экстракция ДН ДНК Высокая Средняя Да 3-6 ч Высокие
Иммуномагнитный захват Клетки/ДНК Средняя Средняя Среднее 2-4 ч Высокие
Зональное центрифугирование Клетки Средняя Высокая Среднее 30 мин Средние
Обогащение Клетки Низкая Высокая Нозкое 6-24 ч Низкие

 

Клинические пробы

Отмечено что как Tfl так и Tth ДНК полимеразы являются более стойкими к водным и стекловидным жидкостям глаза чем Taq, Tli полимеразы и фрагмент Стоффела. Tth ДНК полимераза также в меньшей степени подвержена действию ингибиторов, присутствующих в носоглоточных мазках, чем Taq ДНК полимераза в анализе по выявлению вируса гриппа А. Использование энзимов горячего старта, например AmpliTaq Gold and Platinum Taq уменьшает возможность переносного загрязнения. Кроме того, при использовании AmpliTaq Gold показана повышенная специфичность в мультиплексном ПЦР анализе, детектирующем патогены среднего уха. Амплификация сильно деградированного ДНК из парафиновых образцов ткани с использованием AmpliTaq Gold или Platinum Taq повышает выход до 20 раз в сравнении с Taq. Улучшенная ПЦР амплификация с меньшим фоном была отмечена в сравнительном исследовании AmpliTaq Gold и Platinum Taq с использованием ПЦР методики с задержанным стартом.

Кровь

При исследовании ингибиторного эффекта девяти термостабильных ДНК полимераз, AmpliTaq Gold и Taq ДНК полимераза были полностью подавлены в присутствии 0.004% (v/v) крови в ПЦР смеси, в то время как HotTub, Pwo, rTth, и Tfl ДНК полимеразы были способны амплифицировать ДНК в присутствии 20% (v/v) крови без уменьшения чувствительности амплификации. Кроме того, при добавлении 1% (v/v) крови действие Taq ДНК полимеразы полностью ингибировалось, в то время как таргетная последовательность в присутствии до 4% (v/v) крови амплифицировалась с использованием Tth ДНК полимеразы. Другие условия ПЦР и концентрации таргетной ДНК могут объяснить эти противоречивые результаты относительно эффекта крови на Taq ДНК полимеразу. Также сообщается об усилении выхода амплификации и специфичности при использовании AmpliTaq Gold ДНК полимеразы вместо AmpliTaq ДНК полимеразы в мультиплексной детекции ДНК в крови.

Фекалии

При сравнении эффективности амплификации Tth полимеразы и Taq ДНК полимеразы для выявления Helicobacter hepaticus в фекалиях мышей отмечено 100-кратное увеличение чувствительности с использованием Tth полимеразы в сравнении с Taq ДНК полимеразой. Кроме того Pwo и rTth ДНК полимеразы могут амплифицировать ДНК в присутствии 0.4% (v/v) фекалий без уменьшения чувствительности. Был отмечен ингибиторный эффект микробной флоры в фекалиях свиней на амплификационную способность rTth и Taq ДНК полимеразы при выявлении Clostridium botulinum. Результаты показали уменьшение чувствительности на одну логарифмическую единицу при использовании Taq ДНК полимеразы вместо rTth.

Клеточный материал

ДНК полимеразы из T. aquaticus и T. flavus связываются с короткими двухцепочечными фрагментами ДНК без специфичности к последовательности. Кроме того, накопление продуктов амплификации во время поздних ПЦР циклов также имеет ингибиторный эффект на ДНК полимеразы. Было показано, что главным фактором, который способствует фазе плато в ПЦР, является связывание ДНК полимеразы с ее продуктами амплификации. Taq ДНК полимеразу заменили на Tth ДНК полимеразу для более чувствительной детекции ДНК Staphylococcus aureus в коровьем молоке. Также, детекция клеток птичьего патогена Mycoplasma iowae значительно улучшилось в результате замены Taq ДНК полимеразы на Tth ДНК полимеразу.

Усилители амплификации

В ходе развития методологии ПЦР базовая смесь, содержащая ДНК полимеразу, праймеры, нуклеотиды и реакционный буфер, содержащий Tris-HCl, KCl, и MgCl2, была дополнена многочисленными компонентами для повышения эффективности амплификации. Эти компоненты называются усилителями амплификации. Они могут влиять на амплификацию на разных стадиях и при разных условиях путем
— увеличения или понижения термостабильности ДНК матрицы;
— влияния на частоту ошибок ДНК полимеразы;
— влияния на специфичность системы; 
— уменьшения ингибирования амплификации из-за комплексных биологических проб.
С внедрением новых ДНК полимераз, некоторые поставщики уже добавили усилители амплификации в сопутствующий буфер (Таблице 3).

Таблица 3. Состав буферной системы для ДНК полимераз

ДНК полимераза Tris-HCl (mM) KCl
(mM)
MgCl2 (mM) Triton-X
(vol%)
Tween 20
(vol%)
БСА
(μg/ml)
ЕДТА
(mM)
Глицерин
(vol%)
DyNazyme 100 500 15 1%
Platinum Taq 200 500
rTth 100 1000 0.5% 7.5 5%
Taq 100 500 15
Tth 100 1000 15 0.5% 500

Усилители делят на пять групп:
— белки;
— органические растворители;
— неионогенные детергенты;
— биологически совместимые растворы;
— полимеры.

Конкретное количество усилителей используемых в различных исследовательских группах наведено в Таблице 4.

Таблица 4. Концентрация усилителей при разных применениях

Усилители Концентрация Применение
БСА 4.0 g/L Снижение ингибирования от мяса, крови и фекалий.
БСА 0.4 g/L Снижение ингибирования от билирубина и гуминов.
БСА 0.6 g/L Снижение ингибирования от меланина в ОТ-ПЦР.
gp32 0.1 g/L Снижение ингибирования от мяса, крови и фекалий.
gp32 0.15 g/L Снижение ингибирования от билирубина и гуминов.
ДМСО 5% Восстановление неудавшейся амплификации.
ДМСО 2–10% Усиление ОТ-ПЦР.
Tween 20 2.5 g/L Снижение ингибирования от фекалий.
Tween 20 0.5% Снижение ингибирования от растительных полисахаридов.
Бетаин 117.0 g/L Снижение ингибирования от мяса и крови.
Бетаин 5% ПЦР богатых на GC последовательностей.
Глицерин 10–15% Восстановление неудавшейся амплификации.
PEG 400 5% Снижение ингибирования от растительных полисахаридов.
PEG 400 10–15% Восстановление неудавшейся амплификации.
PEG 400 2.0 g/L Снижение ингибирования от крови.

Белки

Двумя наиболее часто используемыми в качестве усилителей амплификации белками являются БСА и белок связывания одноцепочечной ДНК gp32, который является белком, кодируемым геном 32 бактериофага T4. Добавление БСА к амплификационной смеси ослабляет игибирование амплификации некоторыми веществами, например, кровью, мясом, фекалиями и гемсодержащими веществами. Предполагается, что БСА может помочь преодолеть ингибирование ПЦР кровью или гемсодержащими веществами путем их связывания. Кроме того, показано, что БСА может связывать фенолы и, таким образом уменьшать ингибирование ПЦР. Ингибирование амплификации образцами кала может происходить в результате деградации ДНК полимеразы протеиназами. Белки, например БСА и gp32, могут ослаблять этот эффект ингибирования, выступая в роли мишени для протеиназ. БСА часто используют для стабилизации белков в растворе и, таким образом, возможный способ усиления амплификации может заключаться в стабилизации ДНК полимеразы. Белок gp32 может усиливать амплификацию таким же образом, как и БСА. Однако, gp32 может связывать одноцепочечную ДНК, защищая ее от расщепления нуклеазой, и предполагается, в крови этот белок может улучшать доступность ДНК полимеразы при наличии большого количества коагулированных органических веществ в ПЦР образце.

Органические растворители

Примерами часто используемых органических растворителей, используемых в качестве усилителей ПЦР, являются диметил сульфоксид (DMSO) и формамид. Оба растворителя влияют на термостабильность праймеров и на профиль термальной активности ДНК полимеразы, таким образом увеличивая специфичность амплификации. Влияние на термостабильность вызвано общей способностью органических растворителей дестабилизировать ДНК в растворе.

Неионогенные детергенты

Главными неионогенными детергентами, используемыми в качестве посредника в ПЦР, являются Tween 20 и Triton-X. Добавление Tween 20 стимулирует активность Taq ДНК полимеразы и уменьшает ложные терминации энзима. Механизм такого действия пока остается неясным.

Биологически совместимые растворенные вещества

Бетаин и глицерин являются наиболее часто используемыми усилителями из группы биологически совместимых растворенных веществ. Растворенные вещества используются организмами и клеточными системами для поддержания биологической активности в экстремальных условиях. С этой целью, глицерин используется в буфере хранения термостабильных энзимов. Добавление как бетаина, так и глицерина в реакционную смесь амплификации увеличивает специфичность и уменьшает формирование вторичных структур вызванных богатыми на GC участками. Также, глицерин может усиливать амплификацию, повышая гидрофобные взаимодействия между белковыми доменами и повышая температуру термального перехода белков. Глицерин также может понижать температуру разделения нитей ДНК, таким образом усиливая амплификацию.

Полимеры

PEG и декстран являются полимерами, используемыми в качестве усилителей. PEG может усиливать амплификацию таким же образом, как органические растворители. Также, показано, что PEG снижает игнгибирование, вызванное фекалиями, и сульфатом декстрана, растительным полисахаридом. Кроме того, известно, что PEG имеет свойства стабилизации ферментов сравнимые с БСА, которые служат для поддержания ферментативной активности. Это действие может усилить амплификацию благодаря стабилизации ДНК полимеразы.

Стратегии предварительной ПЦР обработки образцов

Обработка комплексных биологических образцов перед амплификацией является ключевым фактором, определяющим эффективность диагностического ПЦР анализа. Для обеспечения оптимальных условий необходимо соблюдать следующие требования:

— отсутствие или низкая концентрация ПЦР-ингибиторных компонентов в образце;
— достаточная концентрация таргетной ДНК.

Пред-ПЦР обработка призвана превратить комплексный биологический образец, содержащий таргетный микроорганизм, в образцы, которые можно амплифицировать. Поскольку комплексные биологические пробы часто содержат ингибиторы ПЦР, были разработаны многочисленные протоколы Пред-ПЦР обработки. Причиной наличия разнообразия ПЦР протоколов и методов предварительной обработки является то, что подход зависит от природы образца и цели ПЦР анализа. Разработаны разные методы подготовки образцов для удаления или уменьшения эффекта ингибиторов ПЦР без информации об ингибиторе ПЦР и/или понимания механизма ингибирования. Таким образом, описание характера ингибиторов ПЦР являет собой важный шаг в развитии эффективных методов подготовки образцов предназначенных для преодоления действия ингибирующих факторов. Например, ПЦР-ингибиторное действие коллагена было частично подавлено путем регулирования концентрации ионов магния в амплификационной смеси.
Как только матрикс образца охарактеризован относительно ингибиторов ПЦР и концентрации таргетной ДНК, можно прогнозировать будет ли образец подходить для анализа ПЦР. Образцы можно разделить на однородные и неоднородные, при этом большинство комплексных биологических образцов являются неоднородными. Как следствие, условия амплификации ДНК могут быть оптимизированы путем эффективной Пред-ПЦР обработки. Можно использовать несколько разных стратегий предварительной обработки:
— оптимизация метода подготовки образца;
— оптимизация условий амплификации ДНК с помощью альтернативных ДНК полимераз и/или усилителей амплификации;
— сочетание обеих стратегий.
Выбор и оптимизация методов подготовки образцов является наиболее часто используемым способом обхода игнибирования ПЦР. Многие протоколы ПЦР совмещают методы подготовки образцов разных категорий. Распространенная стратегия для диагностической ПЦР состоит из комбинации метода предварительного обогащения с методом биохимической экстракции ДНК или с методом физической подготовки образца. Этап обогащения часто используют для концентрации таргетных клеток до уровня концентраций, обнаруживаемых при ПЦР. Сложность различных методов следует учитывать в свете цели ПЦР анализа, т.е., если результаты будут использованы с целью оценки риска или критической точки контроля.
Краткое описание различных категорий подготовки образцов показано в Таблице 2. В целом, методы экстракции ДНК обеспечивают матрицы высокого качества, но метод обычно сложный. Однако, появились автоматизированные надежные методы экстракции ДНК. Предпочтение отдается физическим методам, поскольку они не влияют на специфичность протокола ПЦР, как могут влиять иммунологические и физиологические методы. Самый простой метод взять ПЦР образец напрямую из обогащенного бульона и растворить образец, из-за наличия ингибиторных компонентов в обогащенном бульоне. В последнее время, была разработана обогащенная среда, совместимая с ПЦР, для детекции Yersinia enterocolitica, поэтому уже нет необходимости проводить Пред-ПЦР обработку образцов мазков. Однако, комплексные матриксы, присутствующие в культуральной среде, могут иметь отрицательное влияние на эффективность ПЦР.
ДНК амплификационная реакционная смесь может быть оптимизирована путем подбора сильной ДНК полимеразы и добавлением усилителей амплификации для обхода ПЦР-ингибиторных эффектов компонентов образца и для поддержания эффективности амплификации. Эта стратегия используется для образцов крови, и с помощью rTth ДНК полимеразы в сочетании с БСА, стало возможным амплифицировать ДНК при наличии по меньшей мере 20% (v/v) крови без потери чувствительности. Кроме того, на основе включения метода подготовки образца и использовании более сильной ДНК полимеразы, был разработан протокол Пред-ПЦР обработки для детекции спор Clostridium botulinum в пробах фекалий свиней. После теплового шока (10 мин при 70°C) и предварительного обогащения на протяжении 18 часов при 30°C, проводили экстракцию ДНК из гомогената фекалий перед проведением ПЦР, а сама ПЦР проводилась с использованием более сильной rTth ДНК полимеразы.