ПЦР для начинающих

Руководство по ПЦР в реальном времени для начинающих

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР – это настоящий краеугольный камень  современной молекулярной биологии. В наше время все большее распространение получает ее «продвинутая» версия под названием полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-time PCR), благодаря которой стало возможным раскрыть максимальный потенциал данной методики.

Чтобы понять суть Real-time PCR, необходимо имеет представление о том, какие процессы проходят в пробирке во время «обычной» ПЦР.

ПЦР представляет собой реакцию амплификации молекул ДНК. Рассмотрим два случая, когда в исследовательской практике возникает необходимость амплифицировать (то есть увеличить во много раз) количество ДНК в образце. Например, для судмедэксперта важно размножить небольшое количество ДНК, которая была найдена на месте преступления. Либо исследователю нужно сравнить два образца и узнать, в каком из них больше ДНК. Для такого рода анализа необходимо, чтобы в образце было достаточно ДНК для ее детекции. Если ДНК слишком мало, в сравниваемых образцах проводят ПЦР при одних и тех же условиях, и по количеству амплифицированного продукта определяется, в каком из образцов было больше ДНК изначально.

Главным веществом, благодаря которому происходит ПЦР, является термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Этот фермент синтезирует цепочку ДНК из свободных нуклеотидов, содержащихся в реакционной смеси (dNTPs), по принципу комплементарности. Матрицами для создания новых цепочек являются исследуемые молекулы ДНК. Важный момент – ДНК-полимераза «работает» на одноцепочечной ДНК, при этом «точка старта» для нее может быть только на двухцепочечной ДНК.

Именно эта особенность данного фермента позволяет амплифицировать только те фрагменты ДНК, которые интересны исследователю, а не весь геном организма сразу. Для этого в реакционную смесь добавляют небольшие фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), называемые праймерами (англ. primer, то есть «первичные»). Они присоединяются (отжигаются) на матричную молекулу ДНК вокруг исследуемого гена, запуская работу полимеразы в нужном направлении.

Контроль ПЦР обеспечивается благодаря смене температуры образцов – за счет этого обеспечивается регуляция активности фермента и присоединения праймеров.

Для того, чтобы начать реакцию, температуру повышают до 95°C. При такой температуре двухцепочечная ДНК денатурирует до одноцепочечной.

Потом температуру понижают до ~60°C. Это позволяет праймерам присоединиться вокруг исследуемого фрагмента.

Таким образом, у полимеразы появляется точка старта, от которой она может начинать синтез новой цепочки ДНК:

Оптимальная температура для работы ДНК-полимеразы составляет 72°C, поэтому на этом этапе цикла (он называется элонгацией) температура образца повышается до 72°C, для того, чтобы фермент работал с максимальной скоростью.

По окончанию цикла мы получаем в 2 раза больше ДНК, чем было в начале.

Такие температурные изменения повторяются по кругу в течение 40 «циклов». То есть, из одной копии ДНК получаются две, из двух – четыре, из четырех – восемь и так далее, пока их количество не будет исчисляться миллиардами.

После амплификации полученную ДНК можно разделить на агарозном геле и окрасить (визуализировать). Чем ярче будет полоса на геле, тем большее количество копий нужных нам генов получилось в результате реакции.

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)

Точно такие же принципы лежат в основе ПЦР в реальном времени. Но вместо того, чтобы оценивать продукты амплификации на геле после проведения реакции, за этим процессом можно наблюдать «онлайн». Обеспечивается это тем, что образец, помещенный в амплификатор, на протяжении всего процесса находится под наблюдением специальной камеры, которая называется детектором.

Существует множество технологий мониторинга процесса ампификации, но суть у них одна: при синтезе каждой новой копии ДНК возникает флуоресцентный сигнал, который улавливается детектором. Чем интенсивней флуоресценция, тем больше продуктов амплификации находится в образце.

ПЦР в реальном времени имеет множество преимуществ перед обычной ПЦР:

  • Во-первых, за реакцией возможно наблюдать с самого начала и сразу увидеть, в каких образцах реакция запустилась успешно, а в каких – нет.
  • Можно очень точно рассчитать эффективность реакции.
  • Нет необходимости проводить гель-электрофорез, так как все показатели реакции будут четко показаны на амплификационной кривой.
  • Самым большим преимуществом является возможность проводить полноценно количественную оценку экспрессии генов. Обычная ПЦР является, в лучшем случае, полуколичественным методом анализа.

Зонд или SYBR® Green. Выбор правильной системы визуализации для вашего эксперимента.

Приступая к планированию ПЦР-анализа, важно определить систему визуализации продуктов реакции. В общем случае, существуют две системы: интеркалирующие красители (напр. SYBR® Green) и растворы, основанные на линейно разрушаемых зондах (напр. TaqMan®). В основе обоих систем состоит принцип генерирования флуоресцентных сигналов при синтезе новых копий ДНК и детекции этих сигналов прибором в режиме реального времени.

SYBR® Green (или любой другой интеркалирующий краситель)

SYBR® Green является наиболее используемым интеркалирующим красителем в современной практике. Кроме него существует множество других красителей подобного класса, но наверняка вы слышали именно о SYBR® Green. Принцип действия у них один: сам краситель имеет собственный флуоресцентный фон, но связываясь с двухцепочечной ДНК, он встраивается между ее цепочками. Это приводит к изменению конфигурации молекулы красителя, заставляя ее  флуоресцировать горазда сильнее. Все просто – чем больше ДНК образуется в процессе ПЦР, тем сильнее происходит флуоресценция в образце.

Линейно разрушаемые зонды (по типу TaqMan®)

ДНК-зонды представляют собой меченые флуоресцентными красителями олигонуклеотиды (короткие фрагменты ДНК). Их нуклеотидная последовательность такова, что они гибридизируются на матричной молекуле ДНК рядом с праймером и дают флуоресцентный сигнал. 5’-конец зонда мечен репортерным флуоресцентным красителем. Чаще всего используется зеленый краситель FAM, но также могут использоваться VIC, ROX, CY5 и другие, которые флуоресцируют на другой длине волны, благодаря чему возможно проводить одновременный анализ по разным каналам детектора. На 3’-конце зонда располагается молекула гасителя – она обеспечивает подавление флуоресценции метки. Таким образом, когда репортерный краситель и его гаситель находятся на физически близком расстоянии друг от друга, общий уровень флуоресценции низкий.

В процессе ПЦР зонд прикрепляется к матричной молекуле ДНК сразу после праймера. Далее, зонд расщепляется полимеразой во время реакции. За счет этого молекула гасителя оказывается далеко от репортера, его флуоресценция возрастает, и так происходит на каждом цикле ПЦР.

Что нужно учитывать: стоимость

Оценка стоимости является неотъемлемой частью планирования исследований. Использование линейно разрушаемых зондов обходится дороже, чем интеркалирующих красителей. То есть, если вас интересует большое количество генов, интеркалирующий краситель будет наилучшим выбором. Если же у вас есть небольшой набор генов и вам надо сосредоточится исключительно на них, следует использовать зонды.

Что нужно учитывать: специфичность

Зонды: В общем случае, линейно разрушаемые зонды дают более точные результаты. Объясняется это их высокой специфичностью. Если вы получаете флуоресцентный сигнал от зонда, то можно быть уверенным, что он гибридизировался именно с целевым участком генома – гибридизация происходит исключительно в ограниченом праймерами пространстве. Благодаря этому нет необходимости проводить постамплификационных анализов для того, чтобы убедиться, что все прошло правильно.

Интеркалирующие красители: Слабым местом интеркалирующих красителей является то, что они неспецифичны. Если во время ПЦР поисходит амплификация не того участка ДНК, либо вовсе нескольких разных участков, вы все равно получаете кривую амплификации, которая идентична кривой при амплификации целевых генов. Интеркалирующие красители генерируют флуоресцентный сигнал при связывании с любой двухцепочечной ДНК, независимо от ее нуклеотидной последовательности. То есть, необходимо проводить дополнительные анализы, которые подтверждают наличие специфичных продуктов амплификации, например, оценку графика температуры плавления ампликонов. Подобные виды анализов требуют высокого уровня квалификации оператора, но только благодаря им можно рассчитывать на достоверность полученных данных.

Что нужно учитывать: количество ДНК-матрицы

Так как интеркалирующие красители обладают малой специфичностью, их эффективность при низкой концентрации ДНК в образце крайне мала. При таких условиях праймеры часто образуют между собой димеры или отжигаются на нецелевых участках ДНК. При этом образуется двухцепочечная ДНК и интрекалирующие красители все равно будут давать сигнал.

Можно взять за правило: если количество ДНК в ваших образцах малое (значение Cq>30), то использование интеркалирующих красителей будет сопряжено с трудностями и рекомендуется применять линейно разрушаемые зонды. Если ДНК много (значение Cq<30), то интрекалирующие красители являются отличным выбором.

Реактивы и наборы реактивов

Все, что вам необходимо для проведения качественого Real-time PCR.

ПЦР в реальном времени является очень информативным и многофункциональным инструментом для молекулярной биологии. При правильном подборе методик, реактивов и оборудования возможно проводить исследования любого уровня сложности в кратчайшие сроки. Как и для опытных исследователей, так и для делающих первые шаги в науке,  компания “ВМТ” окажет вам всестороннюю поддержку – мы являемся профессионалами своего дела и обеспечим максимально качественный результат ваших исследований.

ВМТ® Наборы для выделения ДНК/РНК

Наши наборы для выделения позволяют выделить ДНК и РНК практически из любого образца благодаря технологии сорбента на магнитных шариках – выделение происходит быстро, качественно и легко.

Наборы референтных генов

Для того, чтобы вы имели возможность проводить положительный контроль, ВМТ предоставляет широкий ассортимент референтых генов.