Интерпретация результатов ПЦР в реальном времени
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является мощнейшим инстументом современной молекулярной биологии. Так как в процессе реакции амплифицируется спецефический участок ДНК, ПЦР имеет огромный потенциал для использования в современной ветеринарной практике. Целевыми фрагментами для анализа могут быть, как и функциональные гены, так и отдельные консервативные или вариабельные локусы. Данные фрагменты называются молекулярно-генетическими маркерами. Благодаря молекулярным маркерам стало возможно проводить селекцию животных на совершенно новом уровне, значительно сокращая время выведения новых (или улучшения существующих) пород. Кроме того, молекулярно-генетические маркеры позволяют вести эффективный скрининг племенных животных по наследственным заболеваниям. Вторая особенность молекулярных маркеров – возможность определения видовой принадлежности любого организма – позволяет создавать очень точные и чувствительные тест-системы для детекции возбудителей различных заболеваний (в том числе бактериальных, грибковых, протозойных и вирусных – с точностью вплоть до отдельных штаммов, патотипов или изолятов) и определять состав кормов и сельскохозяйственной продукции (по наличию ДНК организмов, из которых они были изготовлены).
Более информативной и точной модификацией «классической» ПЦР является ПЦР в реальном времени. Этот метод является количественным (или полуколичественным) – в процессе ПЦР происходит постоянное наблюдение образца датчиком, регистрирующим флуоресцентные сигналы на каждом цикле реакции. Полученные в результате амплификационные кривые используются в дальнейшем анализе – по ним можно оценить, например, интенсивность экспрессии определенных генов (и, в следствии, проявление фенотипических признаков или наследственных заболеваний), вирусную нагрузку на организм больного животного (что позволяет выявить заболевание на ранних стадиях), оперативно (в отличие от бактериальных посевов) и точно (в отличие от ИФА) диагностировать бактериальные и протозойные заболевания.
Рассмотрим основные моменты, которые необходимо учитывать при интерпретации результатов ПЦР в реальном времени на примере исследования экспрессии генов.
Подготовка материала – выделение РНК.
Принцип выделения для всех нуклеиновых кислот один и тот же – лизис биоматериала, осаждение нуклеиновых кислот на субстрат, очистка от белков, жиров, углеводов, солей и клеточного дебриса, и элюция нуклеиновых кислот в раствор.
РНК является намного более лабильной молекулой, чем ДНК. Процесс деградации рибонуклеиновых кислот происходит на порядок быстрее. Этому способствует, во первых, их одноцепочечная структура, во вторых – большое количество РНКаз (ферментов, расщепляющих РНК), которые присутствуют как и в самих клетках, из которых производят выделение, так и на поверхности кожи оператора (и всех предметов и оборудования, с которыми он контактировал). Тем более, во многих протоколах выделения ДНК применяется дополнительная обработка образца РНКазами – появляется еще один источник контаминации рабочего места.
Рассмотрев эти особенности, можно выделить ряд обязательных для соблюдения правил подготовки образцов РНК:
- Для уменьшения деградации от эндогенных РНКаз забор биоматериала должен быть проведен непосредственно перед выделением, биоматериал должен быть заморожен в жидком азоте. (Для
разных наборов реактивов условия могут быть разными. Более подробные рекомендации описаны в протоколах выделения.) - Работать исключительно в перчатках и масках. Перчатки, посуду, оборудование и все рабочие поверхности следует обработать деактиватором РНКаз (чаще всего раствором ДЕПК).
- Использовать воду, свободную от РНКаз (RNAse free).
- Не допускать хранения образцов РНК и реактивов для их выделения рядом с растворами РНКаз.
Результаты ПЦР в реальном времени
Что можно измерить с помощью ПЦР в реальном времени?
Если вам необходимо проанализировать экспрессию генов, ПЦР в реальном времени может показать количество мРНК в образцах. В результате реакции амплифицируется небольшой регион мРНК, с помощью олигонуклеотидов и флуоресцентного зонда (как в методике TaqMan). Амплификатор (прибор, в котором происходит ПЦР) измеряет интенсивность флуоресценции зондов в образцах на протяжении каждого цикла. На первых циклах уровень флуоресценции недостаточен, чтобы его мог детектировать прибор, но при дальнейшем прохождении реакции он возрастает многократно. Кривая амплификации имеет так называемую экспоненциальную фазу, после которой следует фаза плато.
Ct (пороговый цикл) обозначает определенный цикл реакции и представляет собой одно из ключевых значений ПЦР в реальном времени. Пороговый цикл наступает, когда график кривой амплификации переходит в экспоненциальную фазу (на этой фазе отрезок кривой амплификации линейный). Порог (порог чувствительности, пороговое значение), который обозначен на рисунке красной прямой, пересекает кривую амплификации в точке наступления экспоненциальной фазы. Порог чуствительности может быть разным для разных видов анализа (если, например, используются разные методики анализа или исследуются разные гены), но всегда одинаковый для всех образцов в одной выборке (или в одном эксперименте).
Суть ПЦР в реальном времени заключается в том, что в каждом цикле реакции количество продукта удваиватся по сравнению с предыдущим. Если, например, значение Ct для двух реакций отличается на 2 цикла (см. рисунок), можно сделать вывод, что в образце А (обозначен фиолетовым графиком) в 4 раза больше копий мРНК, чем в образце Б (обозначен оранжевым графиком).
Чаще всего, данные, полученные в результате ПЦР в реальном времени, позволяют оценить так называемую «относительную экспрессию», то есть, насколько различается интенсивность экспрессии определенного гена у двух организмов. Однако, методика позволяет оценить и абсолютное значение экспрессии генов, но для этого необходимо создать стандарт, в роли которого обычно выступают клонированные целевые участки кДНК, интегрированные в вектор.
Словарь терминов:
Внутренний контроль (внутренний контрольный образец, ВКО). Контрольный ген, который присутствует во всех образцах в выборке.
Например, GAPDH, ACTB, TBP, HPRT, PPIA, YWHAZ.
Калибровочный образец. Калибровочным называют образец, по которому ведется сравнение полученных данных. Он представляет собой точку отсчета (time-zero). Значение RQ для контрольного образца равно 1, так как в таком случае он сравнивается с самим собой.
Ct = Пороговый цикл. Обычно ПЦР в реальном времени проходит в течение 40 циклов. Пороговый цикл наступает тогда, когда кривая амплификации пересекает линию порога чувствительности прибора (в месте, где график кривой амплификации становится линейным). Это значение необходимо для анализа. Чем выше значение порогового цикла (Ct=30-35), тем меньше мРНК находится в образце, так как нужно больше времени для амплификации необходимого для интенсивной флуоресценции количества копий мРНК. Если значение Ct невелико (10-15), это свидетельствует о том, что ген экспрессируется очень активно. Обычно внутренний контрольный образец имеет меньшее значение Ct, чем исследуемые гены.
Дельта Ct = Ct исследуемого гена – Ct внутреннего контрольного образца
Дельта Дельта Ct = ΔCt образца 1 – ΔCt калибровочного образца
Дельта Ct SD = Стандартное отклонение. Стандартное отклонение рассчитывается программным обеспечением по обработке данных анализа на основании значений Ct в трехкратном повторении. Данные достоверны, если Стд. откл. меньше 0,25. Если Стд. откл. Более 0,25, значению RQ доверять нельзя.
Реплики. Повторения (так называемые реплики) можно разделить на технические и биологические. Технической репликой является амплификация одного и того же материала, биологические реплики предполагают выделение мРНК и амплификацию из разного биологического материала.
RQ = Относительное количество = 2 – ΔΔCt. Значение RQ показывает количество продукта амплификации в технических репликах относительно калибровочного образца. Все образцы в рамках эксперимента будут сравниваться с калибровочным.
Например, если RQ=10, это значит, что в исследуемом образце экспрессия проходит в 10 раз более активно, чем в калибровочном. Значение RQ=0,1 говорит о том, что в исследуемом образце экспрессия проходит в 10 раз менее активно, чем в калибровочном.
Достоверными могут считаться данные, если RQ больше 2 или меньше 0,5. Это зависит от особенностей методики. Не исключено, что для одного и того же образца в один день можно получить значение RQ=0,8, а на следующий – 1,2. Если в ваших образцах предполагается малый разброс RQ (отличие в 1,5 раза от каибровочного образца), для анализа следует сделать биологические реплики образцов и они должны быть очень хорошо очищены. Кроме того, для каждого гена необходимо провести по 2 анализа и использовать ПКО с известным RQ.
RQmin и RQmax = диапазон возможных значений RQ с учетом стандартного отклонения ΔCt. Доверительный интервал должен быть 95%.
Если вам необходимо узнать действительную ошибку RQ, следует делать трехкратные биологические реплики. Это позволит выполнить тест Стьюдента для различных групп повторений.
Общее качество данных
При анализе полученных данных удостоверьтесь, что кривые амплификации не имеют резких пиков и параллельны друг другу. Технические реплики должны быть просканированы в пределах 0,5 цикла. Значения Ct должны быть <35. Если вы подозреваете, что кривая амплификации имеет нехарактерный вид, отбросьте данный образец из анализа. Если экспоненциальная фаза начинается позже 35-го цикла, отбросьте данный образец из анализа, либо используйте эти данные с большой осторожностью, удостоверившись, что повторения однообразны.
Если у вас нет доступа к кривым амплификации, и вам необходимо проверить достоверность результатов анализа, можно использовать значения Ct SD или ΔCt SD. Это поможет вам оценить однородность повторений. Значения ΔCt SD <0,25 являются хорошими. Это значение говорит лишь о технической точности измерений. Для большей точности необходимо делать биологические реплики.
Если все гены в ваших образцах выходят на экспоненциальную фазу слишком поздно (включая внутренний контрольный образец) и ваши данные, в целом, имеют плохой вид, следует проверить качество РНК. Низкое качество РНК – основная причина получения плохих результатов анализа. Убедитесь, что РНК не деградировала (с помощью гель-электрофореза или анализатора) и не загрязнена (проверьте коэффициенты поглощения 260/280 и 260/230).
Анализ с множественными внутренними контрольными образцами
Использование двух или более внутренних контрольных образцов крайне рекомендуется, это позволит значительно повысить точность ваших результатов. Протестируйте несколько ВКО и выберите из них тот, который дает меньший разброс между образцами.