Выделение нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии

Методы выделения нуклеиновых кислот

Практически все научные исследования в области молекулярной биологии на той или иной стадии включают этап выделения нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты затем используют в ПЦР (ОТ-ПЦР), секвенировании и для множества других задач, причем технологии выделения различаются не только по принципу своего действия, но и в зависимости от типа биоматериала и последующего применения экстракта.

Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. Рассмотрим самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

Выделение фенол-хлороформом

Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статьях с 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот в большинстве исследовательских лабораторий.

Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в определенных пропорциях и последующем перемешивании и центрифугировании смеси.

При выделении нуклеиновых кислот из сложных исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя лизис биологического материала детергентами или хаотропными агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются органические растворители, такие как Фенол/Хлороформ или Тризолом с последующим осаждением в Изопропиловом спирте. Полное отделение белков от нуклеиновых кислот может быть достигнуто добавлением перхлората натрия.

При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы: водная и органическая, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК. Дополнительно можно попробовать селективное инкубирование с хлоридом лития или специфичное безнуклеазное изолирование с гуанидин хлоридом или гуанидин тиоцианатом, скомбинированное с фенольной экстракцией или этанольной преципитацией. Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях.

Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые нельзя автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени.

Сорбционная экстракция на поверхности silica и silica-spin колонках.

Сорбционная экстракция – методика, в основе которой лежит избирательная сорбция на поверхности silica в присутствие хаотропной соли. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с НК осаждается, а супернатант c ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высокоочищенного препарата НК.

Технология выделения на silica-spin колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках silica, предложенный американскими учёными в 1979 году. Метод колоночного выделения использует то же свойство нуклеиновых кислот адгезироваться на поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.

Чаще всего для лизиса используются хаотропные агенты, например гуанидин тиоцианат, которые дестабилизируют водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия. В таких условиях растворимость ДНК/РНК в воде снижается, а белки денатурируют. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков.

Хаотропная соль необходима не только для лизиса, но и для процесса сорбции нуклеиновых кислот. Также для усиления процесса сорбции в некоторых протоколах рекомендуют добавлять спирт. Нужно отметить, что сорбция ДНК на силике под действием хаотропных солей – процесс, который по-прежнему вызывает много споров. Однако среди всех существующих точек зрения на процесс взаимодействия ДНК с силикой можно выделить несколько основных.

Первая точка зрения состоит в том, что сорбция ДНК на силике происходит за счёт образования катионных мостиков между силанольными группами, расположенными на поверхности силики и фосфатными группами ДНК. Известно, что в растворе при рН 6 – 8 поверхность силики отрицательно заряжена, как и фосфатные группы НК. Из-за электростатического отталкивания взаимодействие между ними невозможно. Однако при добавлении хаотропной соли отрицательный заряд экранируется. В таких условиях молекулы НК сорбируются на поверхности силики за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.

Вторая точка зрения опирается на свойства хаотропных агентов. Известно, что молекула НК в растворе покрыта гидратной оболочкой. Попадая в раствор, молекулы хаотропной соли активно разрушают водородные связи, присоединяя к себе воду. В итоге молекула ДНК, лишённая своей гидратной оболочки, становится гидрофобной. То же самое происходит с поверхностью силики. В итоге между ДНК и силикой возникают гидрофобные взаимодействия, и идёт процесс сорбции.

Согласно еще одной точке зрения основным механизм взаимодействия ДНК и силики является образование водородных связей между водой и молекулами НК. Подобные выводы были сделаны после выявления зависимости между количеством адсорбированной ДНК и диаметром пор силики.

Предполагается, что сорбция происходит за счет взаимодействия гидратных оболочек образованных поверхностью поры и молекул НК. Авторы подчеркивают, что НК лишь частично включается в поры, а основная часть молекул торчит на поверхности. В данной теории не ясным остаётся роль хаотропных солей, присутствующих в растворе. Вследствие этого наиболее вероятными вариантами механизма сорбции представляются первые два, которые являются взаимодополняющими.

Необходимо также отметить, что процесс сорбции лучше всего идет при высокой ионной силе раствора, показателях рН 3,5-6,5 (оптимум рН 5) и температуре выше 37 °С.

Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

Спиртовое осаждение нуклеиновых кислот

После осаждения спиртом нуклеиновые кислоты отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, отмывается 70% этиловым спиртом с последующим центрифугированием. После удаления супернатанта осадок подсушивается и растворяется в водном буфере. Роль соли в протоколе экстракции состоит в том, что её положительно заряженные ионы нейтрализуют отрицательный заряд на сахаро-фосфатном скелете НК, приводя к снижению растворимости последних в воде. В водном растворе электростатическое притяжение положительно заряженных ионов и отрицательно заряженных фосфатных групп подчиняется закону Кулона и зависит от диэлектрической константы раствора. Вода имеет большую диэлектрическую константу, что затрудняет взаимодействие ионов, тогда как этанол с гораздо более низкой диэлектрической константой способствует взаимодействию положительно заряженного иона и фосфатной группы, что приводит к выпадению НК в осадок. Нужно отметить, что НК менее растворима в изопропаноле, чем в этаноле, соответственно для ее осаждения требуются меньшая концентрации изопропанола (для выпадения НК в осадок достаточно присутствия 35 % изопропанола и 0,5 М соли, в то время как этанола требуется около 75% при той же концентрации соли). Таким образом, к образцу изопропанола необходимо добавлять 0,7-1 объема образца, а этанола 2,-2,5 объема. Следовательно, изопропанол предпочтительнее использовать, если есть ограничения по объему используемого пластика (например, есть возможность добавить только один объем образца). В ряде протоколов экстракции предлагается проводить осаждение (преципитацию) НК при пониженной температуре (-20°С). Однако, есть исследователи не согласные с этой теорией; по результатам их экспериментов температура инкубации со спиртом не имеет значительного влияния на выход продукта. Главенствующая роль, по их мнению, должна быть отведена продолжительности центрифугирования.

При выделении малых количеств НК (менее 100 нг) для визуализации осадка и улучшения процесса преципитации рекомендуется использовать соосадители, такие как гликоген, линейный полиакриломид или декстран. В некоторых протоколах экстракции предлагается добавлять соосадители непосредственно к осадителю (этанолу или изопропанолу). Делать этого, однако, не следует, так как соосадитель, попадая непосредственно в спирт, начинает образовывать центры нуклеации в отсутствие НК и, соответственно, при последующем смешивании с образцом в меньшей степени способствует агрегации НК. Соосадитель, таким образом, следует добавлять непосредственно в лизирующий буфер или к образцу.

На предпоследнем этапе выделения ДНК проводится добавление 70% этанола для отмывки осадка от остатков солей. Важно, чтобы отмывка проводилась именно водным раствором спирта, так как соли хорошо растворяются в воде и в гораздо меньшей степени в спирте. Кроме того, использование 70% этанола препятствует переходу НК в водную фазу.

На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере обычно при температуре 56-65°С и вортексировании, что необходимо для лучшего растворения осадка.

Выделение на магнитных частицах

Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют.

Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.

Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena,  ThermoFisher и другие.

Ферментативное температурно-зависимое выделение

Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

Клинический образец помещается в пробирку с лизирующим буфером, затем подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.

Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

Разработки наборов для выделения нашей компании.

На данный момент в нашей компании ВМТ разрабатываются наборы для пробоподготовки на основе всех трех подходов к экстракции НК:

  • Набор на основе сорбционной экстракции. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
  • Набор на основе спиртового осаждения. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
  • Набор для выделения нуклеиновых кислот методом сорбции на silica-spin колонках – наиболее интересная и перспективная разработка.